Aflatoksin Analiz Yöntemi

ALET VE EKİPMANLAR
● Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)
-Dionex P680 HPLC Pump
-Dionex ASI-100 Automated Sample Injector
-Dionex RF 2000 Fluorescence detector(FLD)
-Dionex Thermostatted Column Compartment TCC-100
-Bilgisayar ve yazılım (Packard Bell, Chromeleon)
-HPLC kolonu (C18 -250 mm-5µm- 4,6 mm)
● Türevlendirme Cihazı (Kobra Cell)
● Analitik Terazi (0.01 g hassasiyette)
● Blender (1000 mL, Waring Commercial Blender) 
● Saf Su Cihazı (Millipore Elix 5)
● Ultra Saf Su Cihazı (Millipore Milli Q)
● Filtre Kağıdı (Whatman No:4, Kaba Filtre Kağıdı)
● Mikrofiber Cam Filtre
● Otomatik Pipet (0-1 mL ve 5 mL)
● Laboratuvar Cam Malzemeleri (mezür, erlenmayer, beher, cam huni, pipet vs.)
● Karıştırıcı:Vorteks
●İmmunoaffinity Column 
● Enjektör (20 mL’lik tek kullanımlık)
● Vial (renkli 15 mL’lik)

HPLC MOBİL FAZ HAZIRLAMA
Saf su : ACN : MeOH (550:200:300 / v:v:v) karışım hazırlanır. Çözeltinin litresinde 120 mg KBr ve 350L 4 Molar Nitrik Asit ilave edilir

HPLC ŞARTLARI
Dalga Boyu : Ex: 360nm; Em: 440nm
Sıcaklık : 25 °C
Pompa Akış Hızı : 1 mL/dk
Basınç : ...<300 bar
Enjeksiyon Hacmi : 100 µL

EKSTRAKSİYON
1000 mL’lik blender kabına 50 g numune 0.01g hassasiyetli terazide tartılır. Üzerine 5 g NaCl ilave edilir, 100 mL saf su ve 150 mL MeOH eklenir. 2 dk yüksek devirde karıştırılır. Cam huni kullanılarak kaba filtre kağıdından ve Whatman No:4 filtre kağıdından geçirilerek süzülür. Süzüntüden 20 mL alınır ve üzerine 20 mL saf su ilave edilerek 1:100’ lük mezürde karışmaları sağlanır. Sonrasında mikrofiber cam filtreden geçirilerek süzülür. İmmunoaffinite Safhası
IAC kolonun başındaki mavi kısım çıkarılır ucu kesilir ve tekrar takılır. Kolon bu kısmından enjektöre sabitlenir. 20 mL’lik enjektöre 10 mL ekstrakt alınır (kabuklu ise 20 mL). Kolondan saniyede 1 damla akacak şekilde geçirilir. Daha sonra 2 kez 10 mL saf su geçirilerek yıkama yapılır. Akış hızı 5 mL/dk’yı geçmemelidir. Kolondan birkaç kez hava geçirilip su tamamen çıkarılır. 1 mL MeOH eklenerek kolondan yavaşça geçirilir. Tüm metanol 15mL’lik koyu renkli vialde toplanır. 1 mL saf su ile işlem tekrarlanır ve su aynı viale alınır. Toplam hacim 2 mL olur. Vortekste iyice karıştırılır. 2 mL’lik viale alınarak enjeksiyon yapılır. 100 mikrolitre enjeksiyon yapılır.

Hesaplama ve Sonuç
Önce seyreltme faktörü hesaplanır. 50 g numune 250 mL ye seyreltilir, bu karışımdan 20 mL alınır ve üzerine 20 mL saf su ilave edilir. Bu durumda 40 mL’ de 4 g örnek vardır. İmmunuaffinite kolondan 10 mL ekstrakt geçirilir. Bu durumda kolondan 1 g örnek geçmiş olur. 1 g örnek 1 mL metanol ve 1 mL saf su ile seyreltilir. Sonuçta 1 g örnek 2 kat seyreltilmiş olur, burada seyreltme faktörü 2 dir. Cihaza seyreltme faktörü yazılır ve çıkan pikin integrasyonu alınarak sonuç ppb olarak bulunur.

HPLC Kolunu
C18
a- ODS -2 
b- Length =25 cm 
c- i.d. = 4,6 mm 
d- Particle size =5 µm 
e-Aflatoksin Bı,B2,Gı,G2 , Okratoksin-A ve Aflatoksin M1analizlerinde kullanılacak.
h-Yüksek performanslı olacak.

kaynak: forum.gidagundemi.com