Kromatografik Yöntemler ve HPLC Yöntemi

 Kromatografi Nedir?

Kromatografi, bir karışımda bulunan bileşenlerin birbirinden ayrılmasını gerçekleştiren ve bu sayede kalitatif ve kantitatif analizlerinin yapıldığı yöntemlerin genel adıdır. Bu yöntemlerde çalışma düzeneği temel olarak iki bileşenden oluşur. Bu bileşenlere sabit faz (stationary phase) ve hareketli faz ya da mobil faz (mobile phase) adı verilir. Mobil fazın içerisinde yer alan bileşenler, sabit faza ait dolgu maddesiyle etkileşmeleri sebebiyle, bir miktar tutulurlar. Bu tutulma, örnekteki farklı bileşenler için farklı miktarlarda olur. Böylece bileşenler sabit fazın sonlarına doğru, farklı hızlarda ilerledikleri için, birbirinden ayrılmış vaziyette sabit fazı farklı zamanlarda terkederler. Bu şekilde sabit fazdan çıkan bileşenlerin derişimleri uygun bir biçimde ölçülür ve zamana veya mobil fazın kullanılan hacmine karşı y-ekseninde işaretlenerek “kromatogram” denilen grafikler elde edilir.

 Kromatografi’nin Temel Prensibi ve Tanımları

 Mobil faz (mobile phase): Örnek Bileşenlerini, sabit faz (kolon) boyunca taşıyan, çeşitli fiziksel ve kimyasal özelliklere sahip çözelti veya çözücü karışımları. Kullanılacak mobil fazın seçiminde, analizi yapılacak örnek madde bileşenlerinin özellikleri, kullanılacak sabit faz ve dedektörün özellikleri vb. birçok parametreye dikkat edilmelidir.

 Sabit faz (stationary phase): Mobil faz içerisinde gelen örneğe ait bileşenlerin etkileşime girdikleri ve belirli ölçüde alıkonuldukları fazdır. Kromatografi tekniğinin çeşidine göre tasarlanmış ve çok değişik materyallerden çok farklı ölçülerde imal edilmiş ve “kolon” olarak adlandırılmış sabit fazlar mevcuttur. Özellikle gaz ve sıvı kromatografileri için ticari boyutta oldukça fazla marka ve boyutta kolon üretimi yapılmaktadır. Sıvı kromatografisinin bir çeşidi olan yüksek performas sıvı kromatografisi (HPLC) uygulamalarında kullanılan kolonlar daha çok 30-300 mm uzunluğunda yaklaşık 5 mm iç çapında metalik boru şeklinde olup iç yüzeyleri çok değişik özelliklerde kaplama materyalleri ile kaplanarak, analizi yapılacak madde grupları için modifiye edilebilmektedir.

 Alıkonma (retention): Mobil faz içerisinde gelen, analizi yapılacak maddeye ait bileşenlerin sabit faz ile etkileşime girerek belirli oranda tutulması daha doğrusu yavaşlatılması ve böylece daha geç olarak sabit fazı terk etmesi olayıdır. Bu özellikten yola çıkılarak, belirli sabit analitik koşullar altında, her kimyasal madde için parmak izi niteliği taşıyan alıkonma zamanı (retention time-tR) tanımı türetilmiştir. Bu kavram belirli sabit deneysel koşullarda analizi yapılan maddenin sabit fazı terketmesi için geçen süreyi göstermektedir.

 t0 = kolona ait ölü zaman (column dead time)

tR = alıkonma zamanı (retention time)

t’R = net alıkonma zamanı (net retention time)

tR = t0 + t’R

 Pompa (pump): Sıvı kromatografisinde, özellikle de HPLC donanımında temel bir bileşendir. HPLC uygulamalarında mobil fazı oluşturan çözücü karışımlarının, enjektör, kolon ve dedektör içerisinden belirli, sabit veya değişgen bir hızda, belirli basınç altında geçmesini sağlar. Modern HPLC donanım pompaları bilgi işlemci kontrollü olup, çok çeşitli firma tarafından değişik modellerde üretilmektedir.

 Dedektör (dedector): Kolonda ayırımı yapılan analizlenecek maddeye ait bileşenlerin alıkonma zamanlarına göre sırayla içerisinden geçerken miktar tayinlerinin yapıldığı HPLC donanımıdır. Kullanılacak dedektörün türü analizlenecek maddenin fiziksel ve kimyasal özelliklerine göre seçilmelidir. Dedektörler ölçümünü yaptıkları, analizlenecek maddeye ait, fiziksel özelliğe göre şu şekilde sınıflandırılırlar:

 ·    Ultraviyole/görünür bölge dedektörü (ultraviolet/visible dedector-UV/VIS)

·    Fotodiyot array dedektörü (photodiode array dedector-DAD)

·    Floresans dedektörü (fluorescence dedector-FLD

·    İletkenlik dedektörü (conductivity dedector-CDD)

·    Refraktif indeks dedektörü (refreactive index dedector-RID)

·    Elektrokimyasal dedektör (electrochemical dedector-ECD)

·    Kütle dedektörü (mass dedector-MS)

·    Evaporatif ışık dağıtıcı dedektör (evaporative ligth scattering dedector-EL)

 Kromatogram (Chromotogram): Kromatografik analiz sonucunda elde edilen grafiktir. Y-ekseni, kullanılan dedektörün ölçtüğü fiziksel özelliği (absorbans, fluoresans, iletkenlik, akım, kırılma indisi vb.), X-ekseni ise zamanı göstermektedir (alıkonma zamanı için kolaylık olması bakımından genellikle dakika cinsinden). Zamana karşı Y-ekseninde ölçülen fiziksel özelliğin artıp tekrar azalması şeklinde oluşan pik şeklindeki eğrilerin herbiri analizlenen maddeye ait bir bileşeni göstermektedir. Bu piklere ait değerler (pik alanı, yüksekliği, vb.) kullanılarak kalitatif ve kantitatif analizler yapmak olasıdır.

 Hacim akış hızı (volume flow rate): F ile sembolize edilir, birimi cm3/saniye veya  cm3/dakika olup, alıkonma zamanının alıkonma hacmine bölünmesiyle hesaplanır: F=VR / tR

 Lineer akış hızı (linear flow rate): U ile sembolize edilir, kolon uzunluğunun (L) kolon ölü zamanına (to) bölünmesiyle hesaplanıp birimi cm/saniye’dir: U=L/t0. Lineer akış hızı, kolonun enine kesitinden bağımsız olup, çözücü moleküllerinin kolon boyunca hareketleri sırasındaki ortalama hızlarını gösterir.

 Çözünürlük (resolution): R ile sembolize edilir. Birbirini takip eden 2 adet bileşene ait piklerin birbirinden ayırımlarının başarısını (oranını) gösterir. Takip eden piklere ait maksimalar arası mesafenin 2 pike ait genişliklerin (birimi dakika) toplamına bölünmesiyle hesaplanır. R= [2(tR2-tR1)] / W1+W2. Takip eden pikler için iyi bir çözünürlükten bahsedebilmek için hesaplanan R değerinin 1-1,5 civarında olması istenir.

 Kromatografik Yöntemlerin Tarihçesi 

Sıvı bir mobil fazın kullanıldığı kromatografik yöntemlerin (Sıvı kromatografisi) tarihçesi Rus botanikçi M. S. Twsett’in 1906 yılında yaptığı ve yayımladığı çalışmalarına kadar uzanır . Önceleri düz yüzlemsel yapıda sabit fazlar kullanılmış ve bu teknikler daha sonra kağıt kromatografisi ve ince tabaka kromatografisi olarak isimlendirilmiştir. Modern sıvı kolon kromatografisi ise 1969 yılında HPLC’nin kullanıma girmeye başlamasıyla gelişme göstermiştir.

 Kromatografik Yöntemlerin Sınıflandırılması 

Kromatografik yöntemler kullanılan mobil fazın sıvı veya gaz olmasına göre; Sıvı Kromatografisi ve Gaz Kromatografisi olmak üzere başlıca 2 ana grupta sınıflandırılabilir. Bunun haricinde kromatografik yöntemler, alıkonulma mekanizması ve çalışma metoduna göre de 2 şekilde sınıflandırılabilir:

 Alıkonma Mekanizmasına Göre:

- Adsorpsiyon Kromatografisi (Analizlenecek madde hem mobil faz hem de sabit fazı oluşturan moleküllerle etkileşim içerisindedir. Polar maddeler polar, apolar maddeler ise apolar sabit faz tarafından daha fazla tutulurlar)

 - Partisyon (Dağılım) Kromatografisi (Adsorpsiyon kromatografisinden farklı olarak bu yöntemde sabit fazda sıvıdır. Sıvı sabit fazın getirdiği zorluklar uygulama alanını kısıtlamaktadır)

 - Size Exclusion Kromatografisi (Analizlenecek maddelere ait moleküller boyutlarına göre ayırılmaktadır. Bu işlem için çok değişik por çapları içeren dolgu maddesiyle doldurulmuş kolonlar kullanılmaktadır. Böylece değişik çaplardaki porlar birer elek gibi davranarak maddeleri boyut-çaplarına göre alıkoymaktadır)

 - Afinite Kromatografisi (Alıkonma mekanizması maddeye özgün olmakta ve anahtar-kilit modeline uygun biyolojik materyaller dolgu malzemesi olarak kullanılmaktadır. Maliyetinin çok yüksek olması uygulama alanını kısıtlamaktadır)

 - İyon Değişim Kromatografisi (Yüklü bir maddenin ters yükle yüklenmiş katı bir sabit fazla tutulması  prensibine dayanır)

Çalışma Metoduna Göre: (daha az kullanılan, örneğin kolondan uzaklaştırılma mekanizmasına göre yapılmış bir sınıflandırmadır)

 - Elüsyon Oluştumu Kromatografisi (Elution development chromatography)

 -Yerdeğiştirme Oluşumu Kromatografisi (Displacement Development Chromatography) 

 - Frontal Analiz Kromatografisi (Frontal Analysis Chromatography). 

 HPLC Donanımı 

Standart HPLC donanımı temel olarak 4 bileşenden oluşmaktadır. Bu bileşenler sırasıyla pompa, enjektör, kolon (sabit faz) ve dedektör’dür.

 Pompa

HPLC donanımında yer alan pompalama sistemleri, akış hızına göre, pompanın yapımında kullanılan malzemeye göre ve pompanın mobil fazı iletme mekanizmasına göre olmak üzere 3 farklı şekilde kategorize edilebilmektedir.

 Akış Hızına Göre

- Microbore Pompa Sistemleri: İç çapı 2 mm’ye kadar olan kolonlar için kullanılır ve 1-250 mL/dak aralığında akış hızı sağlarlar.

- Standart Bore Pompa Sistemleri: Analitik HPLC uygulamalarında en sık kullanılan pompa sistemi olup 100 mL – 10 mL/dak aralığında akış hızı sağlarlar. Yarı preperatif HPLC uygulamalarında iç çapı 12 mm’ye kadar olan kolonlar için tercih edilirler.

- Preperatif Pompa Sistemleri: Analitik HPLC uygulamalarının dışındakir çalışma alanlarında kullanılır ve 10 mL/dak’dan büyük akış hızı sağlarlar.

 Pompanın Yapıldığı Malzemeye Göre

- Metalik: En çok tercih edilen metalik malzeme, mekanik dayanıklılığı, aşınma direnci ve iyi termal stabilitesi nedeniyle 316 paslanmaz çeliktir. Mobil fazın bileşenlerinden çok azı (örn. Hidroklorik asit) 316 paslanmaz çeliğe zarar verebilir. Bir diğer metalik malzeme alternatifi ise titanyum’dur. Mekanik dayanıklılık özellikleri 316 paslanmaz çeliğe benzemekle birlikte, aşınma direnci ve kimyasallara karşı inertliği daha fazladır. Titanyum ve çelik materyaller 6000 psi basınca kadar dayanıklıdırlar. Metalik materyallerin sakıncaları olarak ise yüksek maliyetleri, kuvetli asidik ortamlara dayanıksızlık, biyolojik örneklerle geçimsizlik sayılabilir.

 - Ametalik: Metalik pompaların bahsedilen sakıncaları sebebiyle ametalik materyaller de pompa imalinde kullanılmaktadır. Bu amaçla en çok polietiletilketon (PEEK), politetrafloroetilen (TEFLON) ve seramik mateyaller tercih edilmektedir. TEFLON biyolojik örnekler ve asidik ortamlarla geçimli olmakla birlikte 2000 psi basıncın üzerisi için dayanıklı değildir. PEEK ise 5000 psi basınca kadar dayanıklı olup 316 paslanmaz çeliğe zarar veren asidik çözeltilere dayanıklıdır. Ancak HPLC uygulamalarında kullanılan bir çok organik çözücülere dayanıksızdır. Seramik yapı materyali olarak safir 20 yılı aşkın süredir pompalarda özellikle piston parçalarının imalatında kullanılmaktadır. Bu tür malzemeler iyi kimyasal stabiliteye sahip olmakla beraber çok yüksek maliyetleri uygulamalarında kısıtlamalar getirmektedir.

 Mobil Faz İletim Mekanizmasına Göre

- Şırınga Tip Pompalar: Çok kullanılmamakla birlikte akış hızının 100mL/dak’dan daha az olduğu uygulamalarda (örn. Kapiller sıvı kromatografisi uygulamaları) tercih edilmektedirler. 10-50 mL hacminde bir şırıngaya pistonun elektrik motoruyla ittirilmesiyle akış sağlanmaktadır. Sağlanabilecek mobil faz akış süresi şırınganın hacmi ile sınırlı olup, yeniden dolum sırasında akış kesilmek zorundadır.

 - Piston Pompalar: Modern HPLC donanımının standart parçasıdır. Yapısı 2 kısım hareketli parçadan oluşur. Bunlar, check valve’ler ve pistondur.

 Enjektör 

HPLC donanımını oluşturan enjektör örneğin sabit faz (kolon) öncesinde mobil faza enjekte edilmesi için kullanılır. Elle kumanda edilen manuel ve bilgisayar kumandalı oto-enjektörler olmak üzere 2 çeşidi bulunmaktadır.

 - Manuel Enjektörler(Manuel Injector): Örneğin enjekte edilebilmesi için enjektör önce doldurma pozisyonuna (load position)  getirilerek örnek, isteğe göre seçilebilen sabit hacimli,  loop içerisine doldurulur. Loop’a doldurulan örnek hacmi loop sabit hacmini geçerse, fazla olan kısım dışarıya otomatik olarak atılır. Daha sonra enjektörün kolu enjeksiyon pozisyonuna (inject position) getirilerek örnek mobil faz içerisine enjekte edilmiş olur. Kullanılan loop hacimleri çok değişken olup genellikle 5 mL – 5 mL aralığında değişir. Loop hacmi küçüldükçe tekrarlanabilirlik adına yapılan hata oranı da büyümektedir.

 - Oto-enjektörler(Autosampler): 2 tip oto-enjektör mevcuttur. Bunlar XY tipi ve carousel tipidir. XY tipinde enjektör hareketli olup belirtilen koordinatlara giderek örneği şişesinden çekmekte ve loop vasıtasıyla mobil faza enjekte etmektedir. Bunun için seçilen örneklere ait bilgilerin, gerekli yazılım kullanılarak, önceden bilgi işlemciye girilmesi gerekmektedir. Carousel tipinde ise örnekler dönen, dairesel şekilli bir taşıyıcı vasıtasıyla sabit bir enjektörün altına taşınmaktadır.

 Kolon 

Modern HPLC donanımının 4 temel yapı taşından birisi olan kolon, karmaşık örneklerde bileşenlerin birbirinden iyi çözünürlükle ayırımından sorumlu sabit fazdır. Kolon imalatında yapı materyali olarak 316 paslanmaz çelik, TEFLON, cam veya PEEK en sık tercih edilenlerdir. Kolonun ayırım gücü ve performansı yapıldığı materyalden çok, iç yüzeyine yapılan kaplamada kullanılan malzemenin kimyasal ve fiziksel özelliklerinden etkilenmektedir. Kullanılan bu tür kaplama malzemeleri çok çeşitli olup, kullanılacak mobil fazın ve uygulanacak HPLC metodunun özelliklerine ve analizi yapılacak örneğin bilinen kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre seçilmelidir. Seçilecek kolonun HPLC uygulamasında kullanılacak akış hızı ve dolayısıyla oluşacak basınca dayanıklı olmasına dikkat edilmelidir. Birçok analitik kolonun iç çapı 2-5 mm aralığında değişmektedir. Kolon iç çapı arttıkça akış hızı ve iç doldurma hacmi artmakta ama oluşacak piklerin çözünürlüğü dolayısıyla duyarlılık azalmaktadır. Kolonların boyları (uzunluğu) çok çeşitli olup genellikle 30-300 mm aralığında değişmektedir. Kolon uzunluğu arttıkça örnek bileşenlerinin ayırımı daha iyi olmakta fakat analiz süresi uzadığı için daha fazla mobil faz harcanmaktadır. Kolon boyutlarının tanımlanmasına uluslararası standartlar getirilmiştir. Buna göre önce mm cinsinden uzunluk ve çap yazılmakta, bunu firma adı, sabit faz türü, AO türünden poroz yüzey çapı ve mm cinsinden partikül büyüklüğü izlemektedir. Örneğin, 250/4,6  Nucleosil C18 100 – 5 yazıldığında, kolonun 250 mm uzunluk ve 4,6 mm iç çapa sahip olduğu anlaşılmaktadır. Kolonun firması (markası) Nuclesoil olup, sabit faz türü normal fazda kullanılan bir tür olan C18 dir. Poroz yüzey çapı 100 AO olup, dolgu materyaline ait partikül büyüklüğü 5 µm’dir.

 Dedektör 

HPLC donanımında 4 temel bileşenden birisi olan dedektörler, örnek bileşenlerini tayin ederken ölçtükleri fiziksel özelliklere göre, 8 çeşittir:

 A) ULTRAVİOLE / GÖRÜNÜR BÖLGE DEDEKTÖRÜ (Ultraviolet / Visible dedector – UV/VIS): Absorbans ölçülür. Lambert-Beer yasası geçerlidir. Spektrum taraması yapmak, farklı dalga boyunda çalışmak  veya dalga boyunu zamana karşı programlamak mümkündür.

 B) FOTODİYOT ARRAY DEDEKTÖRÜ (Photodiode array dedector-DAD): UV/VIS dedektörden farkı, 512 elementden oluşan bir yüzeyde, her elementin ayrı bir dalga buyundaki absorbansı eş zamanlı olarak ölçebilmesidir. Bu sayede 3 boyutlu kromatogramlar almak ve istenilen her pikin çok hızlı spektrum taramasını görebilmek olasıdır. Ayrıca istenilen dalga boyu aralığında çalışılabilmesi bu dedektörün sağladığı bir diğer önemli avantajdır. Kullanılan ışık kaynağı döteryum veya tungsten lambadır.

 C) FLORESANS DEDEKTÖRÜ (Fluorescence dedector-FLD): Organik maddelerin yaklaşık %15’I fluoresans oluşturma yeteneğine sahiptir. Oluşan fluoresans ölçülmektedir. Kullanılan ışık kaynağı ksenon lamba olup, duyarlılığı UV/VIS dedektöre göre yaklaşık 103 kat fazladır.

 D) İLETKENLİK DEDEKTÖRÜ (Conductivity dedector-CDD): İletkenlik ölçülür. Daha çok anyon ve katyon analizlerinde kullanılır. Sıcaklık kontrolü çok önemlidir bu sebeple kolon fırını içerisinde çalışılmalıdır. Kullanılan mobil fazın iletkenliği ne denli düşük olursa oluşan gürültü de o denli düşük olur.

 E) REFRAKTİF İNDEKS DEDEKTÖRÜ (Refreactive index dedector-RID): Kırılma indisi ölçülür. Sıcaklıktan etkilenir. Örnek bileşenlerinin bulunduğu ortamda yoğunluk artacağından gelen ışık kırılarak hücreyi terkeder. Işığın ölçülen kırılma oranından (kırılma indisi) kantitatif tayin yapılır.

 F) ELEKTROKİMYASAL DEDEKTÖR (Electrochemical dedector-ECD): Elektroaktif maddeler analizlenebilir. Yani bileşenler , belirli potansiyel değerlerinde yükseltgenebilir veya indirgenebilir olmalıdır. Ölçülen fiziksel özellik tayin sırasında oluşan elektrik akımıdır.

 G) KÜTLE DEDEKTÖRÜ (Mass dedector-MS): Örnek bileşenlerine ait çok özgün kromatogramlar elde edilir, dolayısıyla özellikle kalitatif tayinlerde teşhis amaçlı kullanımlarda çok önemli bir dedektördür.

 H) EVAPORATİF IŞIK DAĞITICI DEDEKTÖR (Evaporative ligth scattering dedector-EL)

 HPLC Sistem Türleri 

A) Isocratic sistem (tek pompa, tek solvent, solvent karışım olabilir, ayırım yetersizdir)

B) Düşük basınçlı gradient sistem (tek pompa, max 4 farklı mobil faz, karışma pompadan önce)

C) Yüksek basınçlı gradient sistem (2 yada 3 pompa, 2 yada 3 farklı mobil faz, karışma pompadan sonra)

 HPLC’de Ayırma Teknikleri

A) Normal faz (Normal phase-NP) (ilk geliştirilen teknik, kolon polar, mobil faz apolardır, kullanılan kolonlar silica gel, cyano, amino, diol veya nitro kolonlardır)

B) Ters faz (Reverse phase-RP) (en sık kullanılan teknik, kolon apolar, mobil faz polardır, kullanılan kolonlar C18, C8, C4, phenyl, TMS, Cyano’dur)